Exploration du rôle potentiel des défensines dans la compétence vectorielle différentielle des poux de corps et de tête pour Bartonella quintana

Parasites & Vecteurs volume 16, Numéro d’article: 183 (2023) Citer cet article

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Le corps et les poux de tête des humains sont conspécifiques, mais seul le pou du corps fonctionne comme un vecteur pour transmettre des pathogènes bactériens tels que Bartonella quintana. Les deux sous-espèces de pou n’ont que deux peptides antimicrobiens, la défensine 1 et la défensine 2. Par conséquent, toute différence dans les propriétés moléculaires et fonctionnelles de ces deux sous-espèces de pou peut être responsable de la compétence vectorielle différentielle entre eux.

Pour élucider la base moléculaire de la compétence vectorielle, nous avons comparé les différences dans les propriétés structurelles et les sites de liaison facteur de transcription / microARN des deux défensines dans les poux du corps et de la tête. Les spectres d’activité antimicrobienne ont également été étudiés à l’aide de défensines de pou recombinantes exprimées par baculovirus.

Les séquences complètes d’acides aminés de la défensine 1 étaient identiques chez les deux sous-espèces, tandis que les résidus de deux acides aminés dans la défensine 2 étaient différents entre les deux sous-espèces. Les défensines de pou recombinantes ont montré des activités antimicrobiennes uniquement contre le Staphylococcus aureus à Gram positif, mais pas contre Escherichia coli à Gram négatif ou la levure Candida albicans. Cependant, ils ont montré une activité considérable contre B. quintana, le défensine 2 du pou de corps étant significativement moins puissant que le défensine 2 du pou de tête. L’analyse des séquences régulatrices a révélé que les unités génétiques de la défensine 1 et de la défensine 2 chez les poux du corps possèdent un nombre réduit de sites de liaison au facteur de transcription, mais un nombre accru de sites de liaison aux microARN, ce qui suggère des activités de transcription relativement plus faibles des défensines du pou du corps.

Les activités antibactériennes significativement plus faibles de la défensine 2 ainsi que la probabilité réduite d’expression de la défensine dans les poux de corps contribuent probablement à la réponse immunitaire détendue à la prolifération et à la viabilité de B. quintana, ce qui entraîne une plus grande compétence vectorielle des poux de corps par rapport aux poux de tête.

Le pou du corps humain Pediculus humanus humanus et le pou de tête P. h. capitis sont des ectoparasites hématophages qui passent tout leur cycle de vie sur des hôtes humains et se nourrissent de sang humain. L’infestation par les poux de tête humains cause des problèmes économiques et sociaux, tandis que l’infestation par les poux du corps humain menace la santé publique en vecteur de maladies bactériennes [1]. On pense que le pou de corps a évolué à partir d’un pou de tête conspécifique il y a 40 000 à 70 000 ans, lorsque les humains ont commencé à porter des vêtements [2], et possède une compétence vectorielle supérieure à celle du pou de tête. De ces deux types de poux, seul le pou du corps est connu pour transmettre des agents pathogènes bactériens à Gram négatif, notamment Bartonella quintana, Rickettsia prowazekii et Borrelia recurrentis, qui causent respectivement la fièvre des tranchées, le typhus épidémique et la fièvre récurrente. Cependant, le pou de tête n’est pas connu pour transmettre des maladies bactériennes aux humains, probablement en raison de réponses immunitaires plus élevées par rapport à celles du pou du corps [3,4,5].

Une analyse pangénomique de gènes représentatifs liés au système immunitaire chez les poux du corps et de la tête a révélé un ensemble partagé de 93 gènes, indiquant un système immunitaire significativement rétréci chez les poux humains par rapport à d’autres insectes [3]. Le nombre de gènes associés au système immunitaire humorale est considérablement réduit chez les poux humains, certains gènes immunitaires étant absents dans le génome du pou humain [3, 6]. Ce système immunitaire simplifié chez les poux humains est dû à leur cycle de vie parasitaire au cours duquel ils se nourrissent exclusivement de sang humain, et le sang est considéré comme un régime relativement stérile. Fait intéressant, seuls deux peptides antimicrobiens (AMP), à savoir la défensine 1 et la défensine 2, ont été identifiés dans les génomes des poux du corps et de la tête des humains [3]. L’analyse comparative du transcriptome a révélé que les poux du corps et de la tête ont pratiquement le même bagage génétique [7], ce qui suggère que les différences apparentes de compétence vectorielle entre ces deux types de poux peuvent être dues aux profils transcriptionnels différents des gènes liés au système immunitaire, tels que les défensines. Les niveaux de transcription basale de la défensine 1 et de la défensine 2 se sont avérés significativement plus élevés dans le tissu du tube digestif des poux de tête que dans celui des poux de corps [4]. De plus, l’expression de la défensine 1 pourrait être induite dans les tissus du tube digestif du pou de tête, mais pas dans le pou du corps à la suite d’une provocation orale avec B. quintana [5]. Pris ensemble, ces résultats suggèrent que les réponses immunitaires accrues médiées par l’expression constitutive et inductible des défensines 1 et 2 contribuent à la réduction de la compétence vectorielle dans le pou de tête.

Malgré l’importance des défensines du pou dans les réponses immunitaires et la compétence des vecteurs chez les poux humains, les informations détaillées sur les propriétés structurelles et les fonctions de ces AMP sont rares. Il reste à élucider comment l’expression de la défensine est régulée différemment et s’il existe une différence dans l’activité antimicrobienne des défensines entre le corps et les poux de tête. De plus, l’efficacité des défensines de pou contre les bactéries pathogènes telles que B. quintana reste à déterminer.

Dans cette étude, nous avons caractérisé les propriétés moléculaires et fonctionnelles des défensines de pou. Les sites potentiels de liaison au facteur de transcription et les sites de liaison aux microARN (miARN) pour les défensines du pou ont été comparés entre les poux du corps et de la tête afin d’élucider leurs profils d’expression différentiels inter-sous-espèces. À l’aide de la défensine 1 et de la défensine 2 recombinantes exprimées in vitro, les spectres d’activité antimicrobienne des défensines du pou ont été déterminés et comparés entre les poux du corps et les poux de tête. Les données présentées dans cette étude devraient faciliter une compréhension approfondie de la compétence vectorielle différentielle médiée par les défensines 1 et 2 entre les poux du corps et de la tête.

La souche de pou de San Francisco et la souche de pou de tête du sud de la Floride ont été élevées dans un système d’alimentation par membrane in vitro [8] dans des conditions contrôlées de 30 °C, 70 à 80% d’humidité relative et 16/8 h de lumière / obscurité dans des chambres d’élevage (Institutional Review Board No. E2211/001-003).

Les séquences d’ADN complémentaire de la défensine (ADNc) provenant de poux du corps et de la tête ont été obtenues auprès du National Center for Biotechnology Information (NCBI; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) et d’une publication antérieure [6], et confirmées par le clonage et le reséquençage de l’ADNc de la souche de pou de San Francisco et de la souche de pou de tête du sud de la Floride. Les séquences d’acides aminés des défensines de 38 espèces d’insectes ont été alignées à l’aide du progiciel d’analyse CLC Main Workbench 8 (CLC Bio, Waltham, MA, États-Unis). Un arbre phylogénétique a été construit à l’aide de MEGA X (Pennsylvania State University, University Park, PA, USA) en utilisant la méthode du maximum de vraisemblance basée sur le modèle Jones-Taylor-Thornton (JTT) avec 1000 réplications bootstrap. Le nombre sur chaque nœud de l’arbre indique le pourcentage de valeurs bootstrap basées sur 1000 pseudo-répliques. La modélisation structurale tridimensionnelle (3D) des défensines a été réalisée sur la base des structures des peptides d’insectes défensine A [9] et d’anophèle défensine [10] dans la banque de données sur les protéines. Les séquences des gènes du pou ont été soumises au serveur de modélisation moléculaire du SWISS-MODEL (Automated Comparative Protein Modeling Server) [11] pour la prédiction de structure, et les structures 3D ont été analysées à l’aide du programme UCSF Chimera [12]. Le site de clivage du peptide signal, l’hydrophobicité, le poids moléculaire, le point isoélectrique (pI) et la charge nette à pH 7 ont été prédits à l’aide du serveur SignalP 6.0 (https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP) [13], de l’outil ProtScale (https://web.expasy.org/protscale/) [14], de l’outil Compute pI/MW (https://web.expasy.org/compute_pi/) [14] et du calculateur de propriétés peptidiques (https://pepcalc.com/), respectivement. Les sites de liaison au facteur de transcription dans la région 5' en amont des gènes ont été prédits à l’aide du programme de découverte de motifs PROMO (http://alggen.lsi.upc.es/). La région régulatrice putative de 1000 pb du gène cible (séquences d’ADN génomique en aval de 800 pb en amont plus 200 pb en aval du site de départ de la transcription) a été utilisée pour la prédiction du site de liaison au facteur de transcription. Les séquences ont été obtenues à partir des données de séquençage de la base vectorielle (http://www.vectorbase.org) et du génome du pou de tête [6] pour les poux du corps et de la tête, respectivement. Les régions 3'-non traduites (UTR) dans les défensines 1 et 2 transcrits du corps et des poux de tête ont été utilisées pour la prédiction des miARN à l’aide de la base de données de séquences miARN miRBase (http://mirbase.org) [15]. Le seuil de valeur E était de 10, et la base de données de séquences de miARN d’arthropodes a été utilisée pour des prédictions spécifiques.

L’ARN total de cinq poux du corps et de la tête a été extrait à l’aide de 200 μl de réactif TRI (Molecular Research Center, Cincinnati, OH, États-Unis), selon les instructions du fabricant. Pour éliminer la contamination de l’ADN de l’ARN total, la DNase I (Takara Bio, Kyoto, Japon) a été traitée et l’ADNc a été synthétisé à l’aide de la transcriptase inverse SuperScript IV (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, États-Unis) avec des amorces oligo dT. Le peptide signal et les régions peptidiques matures des défensines 1 et 2 du pou du corps et de la défensine 2 du pou de tête ont été amplifiés séparément à l’aide d’amorces spécifiques au gène (Fichier supplémentaire 1: Tableau S1) avec Advantage Taq (Clontech, Palo Alto, CA, États-Unis). Ceux-ci ont ensuite été insérés ensemble dans le vecteur pBacPAK8 (Clontech) avec des amorces simple brin complémentaires contenant un His-Tag de 6×. Les séquences plasmidiques pour chaque étape de clonage ont été vérifiées par séquençage de l’ADN (Macrogen, Séoul, Corée). Des vecteurs de transfert contenant des défensines ont été co-transfectés avec l’ADN BacPAK6 (Clontech) dans des cellules Sf9 (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) cultivées dans un milieu TC-100 (WelGENE, Gyeongsan, Corée) complété par 10% de sérum fœtal bovin (WelGENE) à 27 °C (Fichier supplémentaire 2: Tableau S2). Après 5 jours de transfection avec le réactif Bacfectin (Clontech), le surnageant a été prélevé sur les cellules infectées et utilisé comme stock de virus. Le premier stock de virus a été ensemencé sur 5 × 106 cellules Sf9, et le surnageant a été recueilli après 3 jours d’infection par centrifugation à 3300 rpm pendant 15 min à 4 °C. Le surnageant a été concentré à l’aide d’une unité de filtre centrifuge Amicon Ultra-4-3 kDa (MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) par centrifugation à 7500 × g pendant 40 min à 4 °C. Le surnageant concentré a été chargé dans une colonne d’affinité HisTrap HP de 5 ml (GE Healthcare, Pittsburgh, PA, USA) et équilibré avec un tampon de liaison (50 mM NaH2PO4 et 300 mM NaCl contenant 5 mM d’imidazole, pH 8,0) à un débit de 5 ml/min en utilisant AKTAprime plus FPLC (GE Healthcare). La colonne d’affinité HisTrap HP de 5 ml a été lavée avec 40 ml de tampon de lavage (50 mM NaH2PO4 et 300 mM NaCl contenant 10 mM d’imidazole, pH 8,0) et éluée avec un tampon d’élution (50 mM NaH2PO4 et 300 mM NaCl contenant 250 mM imidazole, pH 8,0). Les fractions avec pics d’élution ont été recueillies et concentrées à l’aide d’une unité de filtre centrifuge Amicon Ultra-4-3 kDa (MilliporeSigma) par centrifugation à 7500 × g pendant 40 min à 4 °C, et le tampon a été échangé avec un tampon Tris-HCl (20 mM NaCl, pH 7,8) de 100 mM pour réduire la concentration d’imidazole. La concentration de l’échantillon de peptide purifié a été quantifiée à l’aide du kit de dosage des protéines Pierce BCA (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific), avec de l’albumine sérique bovine comme protéine standard.

Escherichia coli à Gram négatif (American Type Culture Collection [ATCC] no. 11775), Staphylococcus aureus à Gram positif (ATCC no. 12600) et Candida albicans (ATCC no. 10231) ont été cultivés dans du bouillon Luria-Bertani, du bouillon d’infusion de cœur cérébral et du bouillon de dextrose de pomme de terre, respectivement, à 200 rpm dans un incubateur à agitation à 37 °C pendant la nuit, après quoi les bactéries cultivées ont été diluées 100 fois dans le même bouillon de culture. Après que la densité optique ait atteint 0,5 à 600 nm (OD600), 10 μl aliquotes de chacune des défensines recombinantes 1 et 2 à différentes concentrations ont été incubées avec 90 μl de culture bactérienne dans une plaque de 96 puits dans un incubateur à agitation à 37 °C à 200 tr/min pendant la nuit. Le tampon Tris-HCl a été utilisé comme témoin négatif. Les valeurs OD600 ont été mesurées à l’aide d’un lecteur de microplaques VersaMax (Molecular Devices, San Jose, CA, États-Unis). La concentration inhibitrice demi-maximale (CI50) a été calculée à l’aide de GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, San Diego, CA, États-Unis), et des tests d’activité antimicrobienne ont été effectués avec trois réplications.

La souche de type sauvage B. quintana JK31, obtenue à l’origine du Dr Jane Koehler (Université de Californie, San Francisco, CA, États-Unis), a été conservée dans une installation de niveau de biosécurité 2 à l’Université nationale de Séoul (love my life08-1090). Les bouillons congelés de B. quintana ont été cultivés sur une assiette de gélose au chocolat dans un pot d’extinction de bougies à 37 °C pendant 10 jours et passés dans une assiette de gélose fraîche pendant 7 jours supplémentaires de culture. Des cellules cultivées de B. quintana ont été récoltées et rincées avec 1 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) par centrifugation à 1000 × g pendant 4 min. Après deux rinçages supplémentaires, les pastilles ont été remises en suspension dans 100 μl de PBS. Des aliquotes de 5 μl de la suspension bactérienne de 100 μl ont été diluées en série avec du PBS; puis 12 μl de chaque suspension bactérienne diluée de 1000 fois ont été soigneusement mélangés avec 12 μl de gentamicine 100 μM comme témoin positif, 100 mM de tampon Tris-HCl comme témoin négatif et 100 μM de défensines recombinantes 1 et 2 du pou du pou 2 du pou de défensine 2 du pou de tête. Au total, 8 μl du mélange ont été déposés trois fois sur une plaque de gélose au chocolat, et le nombre d’unités formant colonies (UFC) a été calculé après incubation dans un pot d’extinction de bougie à 37 °C pendant 10 jours. L’indice de colonie a été obtenu en divisant les UFC/μl par les UFC/μl du témoin négatif.

Les activités hémolytiques des défensines 1 et 2 recombinantes du pou du pou du corps et de la défensine 2 du pou de tête ont été évaluées à l’aide de globules rouges humains (GR) comme décrit précédemment [16]. Les globules rouges ont été lavés 3 fois avec du PBS pendant 15 minutes à 960 tr/min, puis remis en suspension dans du PBS à une concentration de 2%. Des aliquotes de 10 μl de défensines recombinantes à quatre concentrations (10, 20, 50 et 100 μM) et des antibiotiques à cinq concentrations (10, 20, 50, 100 et 200 μM) ont été incubées avec 90 μl de globules rouges pendant 30 min à 37 °C et centrifugées pendant 15 minutes à 960 tr/min. L’OD540 du surnageant a été mesurée à l’aide d’un lecteur de microplaques VersaMax (Molecular Devices), et les activités hémolytiques relatives du tampon Tris-HCl et du Triton X-100 à 0,1 % ont été considérées comme étant respectivement de 0 % et 100 %. Les tests hémolytiques ont été effectués avec trois réplications, et le protocole a été approuvé par le comité d’examen institutionnel (comité d’examen institutionnel n° E2211/001-003).

À chaque moment, toutes les données expérimentales ont été recueillies en trois exemplaires. Une analyse unidirectionnelle de la variance avec le test de comparaison multiple de Tukey et les tests t non appariés ont été utilisés pour déterminer les différences significatives en interprétant les valeurs P. La signification statistique a été fixée à P < 0,05 et l’analyse statistique a été effectuée à l’aide du logiciel GraphPad Prism 6.01 (logiciel GraphPad).

Les défensines 1 et 2 des poux du corps et de la tête ont été alignées à l’aide de l’établi principal 8 de la CLC (Qiagen, Hilden, Allemagne) (Fig. 1). Les séquences de défensine de pou de corps 1 (BLDef1) et de défensine de pou de tête 1 (HLDef1) correspondaient complètement à la séquence BLDef1 de référence (numéro d’acquisition : XP_002428138.1). BLDef1 et HLDef1 étaient identiques et se composaient de 109 acides aminés, dont un peptide signal de 20 acides aminés, un propeptide de 46 acides aminés et une région peptidique mature de 43 acides aminés. La séquence ORF de la défensine 2 du pou de corps (BLDef2) était complètement identique à la séquence de référence (numéro d’acquisition : XP_002432619.1), mais était légèrement différente de la séquence de défensine 2 du pou de tête (HLDef2). Par rapport à la séquence HLDef2 de 116 acides aminés, BLDef2 était composé de 113 acides aminés en raison de la délétion d’un résidu de cystéine dans la région peptidique signal et de deux résidus (lysine et acide glutamique) dans la région propeptidique; en outre, deux substitutions d’acides aminés ont été trouvées entre BLDef2 et HLDef2: l’une dans la région propeptidique (glutamine à la position d’acide aminé 29 pour BLDef2 vs arginine à la position d’acide aminé 30 pour HLDef2) et l’autre dans la région peptidique mature (tyrosine à la position d’acide aminé 105 pour BLDef2 et acide aspartique à la position d’acide aminé 108 pour HLDef2). Le remplacement radical des acides aminés de l’acide aspartique par de la tyrosine dans le peptide mature de BLDef2 impliquait la possibilité d’activités biologiques différentes entre BLDef2 et HLDef2.

Alignements des séquences d’acides aminés de la défensine 1 et de la défensine 2 des poux du corps et de la tête avec d’autres insectes se nourrissant de sang, y compris les puces de chat et les espèces hémiptères. La flèche indique le point de départ des régions peptidiques matures, les astérisques indiquent le site de clivage du dipeptide pour les protéases de type trypsine, les triangles ouverts indiquent différents acides aminés entre BLDef2 et HLDef2, les triangles remplis indiquent les six résidus de cystéine conservés. Les séquences de BLDef1 (XP_002428138.1) et BLDef2 (XP_002432619.1) ont été obtenues à partir de la base de données du National Center for Biotechnology Information (NCBI). BL, pou de corps; Def1, défensine 1; Def2, défensine 2; Cf. Ctenocephalides felis; Cl, Cimex lectularius; HL, pou de tête; Rp, Rhodnius prolixus

Des sites de clivage dipeptidiques conservés (-RR- et -KR- dans les défensines du pou humain et d’autres insectes, respectivement) pour les protéases de type trypsine ont été trouvés entre les régions propeptidique et peptidique mature [17], et six résidus de cystéine conservés étaient présents dans les régions peptidiques matures de toutes les défensines examinées (Fig. 1). Le point de départ des régions peptidiques matures dans toutes les défensines contenait des résidus d’alanine et de thréonine (-AT-), à l’exception de la défensine 1 et 2 de la puce du chat (-VT-). La région C-terminale de toutes les défensines examinées a montré une conservation élevée de deux résidus basiques, soit l’arginine-arginine (RR) ou l’arginine-lysine (RK). Les similitudes de séquence des peptides matures dans les défensines 1 et 2 parmi les espèces d’insectes examinées étaient relativement plus élevées (51,2-72,1% et 60,5-66,7%, respectivement) par rapport aux séquences complètes (33,3-46% et 31,9-35,9%, respectivement).

Les défensines 1 et 2 des 33 espèces d’insectes (2 Phthiraptera, 6 Diptères, 14 Hyménoptères, 5 Hémiptères, 3 Coléoptères, 1 Siphonaptera, 1 Thysanoptères, 1 Orthoptères) étaient alignées avec celles des poux de corps, et les défensines 1 et 2 des 46 espèces d’insectes (2 Phthiraptera, 5 Diptères, 30 Hyménoptères, 4 Hémiptères, 2 Coléoptères, 2 Lépidoptères, 1 Siphonaptera) étaient alignées avec celles des poux de tête (Fichier supplémentaire 3 : Figure S1). Les régions peptidiques matures des défensines des espèces d’insectes présentaient des similitudes de séquence plus élevées que celles des séquences 5'. En particulier, six résidus de cystéine ont été conservés dans la plupart des régions peptidiques matures, démontrant que les six résidus de cystéine sont l’un des motifs structurels représentatifs de la plupart des défensines d’insectes. Dans l’arbre phylogénétique, les défensines 1 et 2 des poux du corps et de la tête se sont regroupées avec les défensines 1 et 2 de la puce du chat, Ctenocephalides felis (Siphonaptera), malgré la distance taxonomique entre les poux et les puces (Fig. 2).

Arbre phylogénétique des défensines d’espèces d’insectes. La case pointillée rouge indique le clade des défensines de pou. L’analyse phylogénétique a été réalisée à l’aide de la méthode du maximum de vraisemblance basée sur le modèle Jones-Taylor-Thornton (JTT) avec 1000 réplications bootstrap. Les pourcentages de valeurs bootstrap sont représentés sur chaque nœud de l’arborescence. D, Diptères; Moi, Ixodida; S, Siphonaptera; P, Phthiraptera; H, Hémiptères

BLDef1 et HLDef1 possédaient le moins d’acides aminés chargés positivement (14), montrant ainsi une valeur pI relativement plus faible (6,84) et une charge nette à pH 7 (- 0,2). L’hydrophobicité (40,37 %) de BLDef1 et HLDef1 était supérieure à celle de BLDef2 et HLDef2 (35,34 %) (tableau 1). Les propriétés structurelles globales de BLDef2 et HLDef2, telles que la valeur pI, la charge nette et l’hydrophobicité, étaient identiques, à l’exception du nombre d’acides aminés chargés positivement (18 et 19, respectivement). BLDef1 et HLDef1 présentaient également le plus faible nombre d’acides aminés chargés positivement (10) parmi les défensines éliminées par propeptide, mais présentaient le pI (9,61) et la charge nette (6,8) les plus élevés. BLDef2 et HLDef2 enlevés par propeptide possédaient un nombre identique d’acides aminés chargés positivement (11) et un pourcentage identique d’hydrophobicité (38,24%), tandis que le pI (8,46 et 8,29, respectivement) et la charge nette (6,5 et 5,5, respectivement) étaient différents et inférieurs à ceux de BLDef1 et HLDef1 enlevés par propeptide. Les défensines natives et les défensines éliminées des propeptides du corps et des poux de tête présentaient des poids moléculaires similaires (12,1 à 12,9 et 6,9 à 7,4 kDa, respectivement).

Une analyse structurelle 3D a révélé que BLDef1 et HLDef1 consistaient tous deux en une seule α-hélice identique (His83-Lys93), tandis que BLDef2 et HLDef2 comprenaient une α-hélice (Asn87-Ile96) et deux feuilles β (β1: Gly104-Cys107; β2: Cys112-Arg115) (Fig. 3). Le peptide mature de la défensine 2 contenait un acide aminé différent dans la boucle entre les deux feuilles de β antiparallèles, ce qui a provoqué une légère distorsion de la boucle, comme l’a noté l’examen de l’image fusionnée (Fig. 3); cependant, les structures globales de BLDef2 et HLDef2 étaient presque identiques.

Structures protéiques tridimensionnelles du pou défensine 1 (panneau de gauche) et de la défensine 2 (panneau de droite) du corps (en haut) et des poux de tête (au milieu). L’image du bas est l’image fusionnée. Les chaînes latérales de différents acides aminés entre le pou du corps défensine 2 et la défensine 2 du pou de tête sont représentées. N-ter, N-terminal; C-ter, C-terminal

Six sites putatifs de liaison aux facteurs de transcription, y compris les sites de type bossu (Hb), déformé (Dfd), même sauté (Eve), sans queue (Tll), apparié (Prd) et mères contre les sites de type dpp (Mad), ont été couramment identifiés dans les régions régulatrices putatives (800 pb en amont et 200 pb en aval du site de début de la transcription) de BLDef1 et HLDef1, avec un site de liaison supplémentaire de type Hb présent à 796-802 pb en amont de HLDef1 (Fig. 4). Dans le cas de la défensine 2, cinq facteurs de transcription, y compris les sites de type Hb, de type Dfd, de type Eve, de type Mad et de type facteur e2 (E2F), ont été couramment trouvés dans BLDef2 et HLDef1, avec un site supplémentaire de type Hb présent à 88-94 bp en amont de HLDef2 (Fig. 4).

Motifs potentiels de liaison au facteur de transcription observés dans la région régulatrice putative (800 pb en amont et 200 pb en aval du site de départ de la transcription du gène). Les barres avec différentes couleurs et motifs représentent différents motifs potentiels. Différents motifs entre le corps et le pou de tête sont indiqués par un astérisque. BLDef, Défensine de pou de corps; HLDef, défensine de pou de tête; Dfd, déformé; Eve, même sautée; Hb, bossu; Mad, les mères contre dpp; Prd, jumelé; T11, sans queue

Six sites putatifs de liaison aux miARN ont été prédits dans le 3′UTR du transcrit BLDef1, tandis que trois sites putatifs de liaison aux miARN ont été prédits dans le transcrit HLDef1 (tableau 2). Dans les 3'UTR des transcrits de défensine 2, cinq sites putatifs de liaison aux miARN ont été prédits dans BLDef2, tandis que quatre sites putatifs de liaison aux miARN ont été prédits dans HLDef2 (tableau 2).

Les témoins positifs, y compris l’ampicilline, la kanamycine et la gentamicine, ont inhibé la croissance d’E. coli et de S. aureus; cependant, la croissance de C. albicans n’a pas été inhibée, même aux concentrations les plus élevées de ces antibiotiques (200 μM) et BLDef1 et BLDef2 recombinants (100 μM) (tableau 3). L’ampicilline inhibait S. aureus, avec des valeurs de concentration inhibitrice demi-maximale (CI50) 44,5 fois inférieures (P = 0,0007) à celles contre E. coli, tandis que la kanamycine inhibait E. coli, avec des valeurs de CI50 8,5 fois inférieures (P = 0,002) à celles contre S. aureus, ce qui indique que ces deux antibiotiques possèdent des activités antimicrobiennes très spécifiques qui dépendent de l’espèce bactérienne. La gentamicine présentait des valeurs de CI50 inférieures contre E. coli et S. aureus que les deux autres antibiotiques et défensines recombinantes du corps et des poux de tête. BL/HLdef1 et BLDef2 recombinants purifiés n’ont inhibé la croissance de S. aureus, avec des valeurs de CI50 similaires (33,2 ± 1,4 μM et 34,4 ± 0,8 μM, respectivement ; P = 0,2669), qui étaient environ 20 et 48 fois moins puissants que l’ampicilline (P < 0,0001) et la gentamicine (P < 0,0001), respectivement, mais 1,8 fois plus puissants que la kanamycine (P = 0,0093 et 0,0114, respectivement). HLDef2 a montré des valeurs de CI50 6,1, 6,4 et 11,4 fois inférieures à celles de BL/HLDef1 (P = 0,004), BLDef2 (P = 0,0031) et kanamycine (P < 0,0001), respectivement. Ces résultats indiquent que les défensines du pou possèdent une activité antimicrobienne spécifique aux bactéries à Gram positif plus efficace que la kanamycine, et que HLDef2 possède une activité antimicrobienne significativement plus élevée contre S. aureus à Gram positif que BLDef2.

Le traitement par la gentamicine 50 μM comme témoin positif a entraîné une inhibition de 98,4 % de la croissance des colonies de B. quintana par rapport au témoin négatif traité par Tris-HCl (Fig. 5). Le HLDef2 recombinant a montré une activité antibactérienne significativement plus élevée contre B. quintana (97,2%) (P < 0,0001) que le BLDef2 (31,5%) (P = 0,0023). Le BL/HLDef1 recombinant n’a montré aucune activité antibactérienne apparente contre B. quintana.

une image représentative de la gentamicine (P, témoin positif), du tampon Tris-HCl (N, témoin négatif) et du mélange de Bartonella quintana traité par BL/HLDef1, BLDef2 ou HLDef2 déposé sur une plaque de gélose au chocolat. La gentamicine et le tampon Tris-HCl ont été utilisés comme témoins positifs et négatifs, respectivement. b Résultat du dosage d’inhibition du mélange de B. quintana avec des défensines de pou recombinantes. L’indice de colonie a été obtenu à partir d’unités formant colonies/microlitres (UFC/μl) divisées par les UFC/μl de contrôle négatif en supposant que B. quintana n’est pas inhibé par le tampon Tris-HCl. Les résultats ont été analysés statistiquement à l’aide d’une analyse unidirectionnelle de la variance Les astérisques indiquent des différences significatives à **P < 0,01 et ***P < 0,0001; NS, pas de différence significative. BL/HLDef1, Pou de corps/pou de tête défensine 1; BLDef2, défensine de pou de corps 2; HLDef2, défensine de pou de tête 2

Les défensines des insectes sont généralement actives contre un large éventail d’agents pathogènes [18]. Bien que le BL/HLDef1 recombinant n’ait été actif que contre S. aureus à Gram positif, le BL/HLDef2 recombinant a montré une activité antibactérienne significativement élevée contre S. aureus à Gram positif et B. quintana à Gram négatif. Des cas similaires, dans lesquels la défensine a montré une activité contre les bactéries à Gram négatif, ont déjà été rapportés chez divers arthropodes [19,20,21,22,23,24]. Cependant, les défensines de pou n’ont montré aucune activité hémolytique apparente malgré leurs activités antibactériennes substantiellement élevées, une observation également rapportée pour d’autres défensines [17, 25].

Les défensines d’insectes ont généralement une boucle N-terminale et une α-hélice suivie d’une structure antiparallèle en β feuille reliée par des liaisons disulfure [26]. BL/HLDef2 a montré ces structures uniques; cependant, BL/HLDef1 semblait n’avoir qu’un fragment α-hélicoïdal et trois paires de cystéine spécifiques à la défensine sans feuille de β. De plus, les défensines de pou ont montré des valeurs de pI élevées, similaires à celles d’autres désinsines d’insectes qui exercent une activité antibactérienne par l’interaction entre des peptides chargés positivement et des composants de membrane bactérienne chargés négativement (c.-à-d. polysaccharide et lipopolysaccharide chez les bactéries à Gram positif et à Gram négatif, respectivement) [27].

Parmi les trois domaines des défensines (peptide signal, propeptide et peptides matures fonctionnels), le propeptide est généralement considéré comme inhibant l’activité antimicrobienne du domaine C-terminal dans les α-défensines (PNH) des neutrophiles humains par ses charges nettes opposées [28]. L’activation des PNH cationiques nécessite l’excision protéolytique du propeptide anionique [29], ce qui indique que les forces électrostatiques pourraient être critiques pour les interactions intermoléculaires inhibitrices entre le peptide cationique mature et le propeptide anionique de la défensine [29]. Les propeptides et les peptides matures de BL/HLDef1 et de BL/HLDef2 présentaient également des charges nettes opposées: la charge nette du peptide mature cationique de BL/HLDef1 était de 7,8, et celles de BLDef2 et HLDef2 étaient de 7,8 et 6,8, respectivement. En revanche, les charges nettes du propeptide anionique de BL/HLDef1 étaient de - 8, et celles de BL/HLDef2 étaient respectivement de - 2 et - 1. Étant donné que ces résultats indiquent une interaction électrostatique inhibitrice potentielle entre le propeptide et le peptide mature des défensines de pou, nous n’avons exprimé que les domaines peptidiques matures des défensines de pou sans propeptides et étudié leurs propriétés biologiques.

Le HLDef2 recombinant a montré une activité antibactérienne significativement plus élevée contre B. quintana à Gram négatif et S. aureus à Gram positif que le BL/HLDef1 ou le BLDef2 recombinant. Étant donné qu’un seul résidu d’acide aminé (tyrosine pour BLDef2 vs acide aspartique pour HLDef2) dans la région peptidique mature de la défensine 2 diffère entre les poux du corps et de la tête, cette différence d’acides aminés est probablement responsable de l’activité antibactérienne différentielle contre B. quintana et S. aureus. Le seul facteur significativement différent causé par la substitution d’acides aminés dans les propriétés structurelles entre BLDef2 et HLDef2 était la charge nette à pH 7. L’augmentation de la charge nette (+ 6,5 pour BLDef2 contre + 5,5 pour HLDef2) résulte de la substitution de l’acide aspartique par de la tyrosine dans BLDef2 et peut contribuer à la réduction de l’activité antibactérienne contre B. quintana à Gram négatif et S. aureus à Gram positif, comme on l’observe généralement dans les défensines des insectes, où une charge nette plus faible est associée à des activités antimicrobiennes élevées contre les bactéries à Gram négatif [30]. De plus, comme l’a démontré l’ingénierie de la Nasonia vitripennis defensin comme modèle [31], le sous-domaine β-feuille des défensines des insectes est un facteur important pour une large activité antibactérienne contre les bactéries à Gram positif et à Gram négatif. Par conséquent, l’altération structurelle dans le sous-domaine de la feuille de β causée par la substitution par un résidu de tyrosine au β-tour est susceptible d’affecter l’activité antibactérienne de BLDef2. Ensemble, l’augmentation de la charge nette et le changement structurel dans le sous-domaine de la feuille de β de BLDef2 semblent être les principaux déterminants de la réduction de l’activité antibactérienne, en particulier contre B. quintana dans les poux de corps, ce qui a probablement augmenté la compétence des vecteurs.

La seule différence dans les sites de liaison au facteur de transcription de la défensine 1 et 2 entre le corps et les poux de tête était la présence d’un site de liaison supplémentaire à la protéine Hb dans les régions régulatrices de HLDef1 et HLDef2. Le bossu appartient à la famille des protéines à doigts de zinc C2H2 qui fonctionnent comme une protéine régulatrice des gènes [32]. Il n’est pas clair si les protéines de type Hb activent ou répriment la transcription des gènes de la défensine dans le corps et les poux de tête. Néanmoins, en supposant le rôle activateur de transcription de la protéine de type Hb chez les poux, la présence d’un site de liaison supplémentaire pour la protéine de type Hb dans HLDef1 ou HLDef2 peut entraîner un taux de transcription basal plus élevé chez les poux de tête [4] et l’expression inductible de la défensine 1 dans les tissus du tube digestif des poux de tête à la suite d’une provocation orale avec B. quintana [5]. Les miARN sont une classe d’ARN courts, endogènes et non codants d’une longueur de 21 à 24 nucléotides qui régulent l’expression génique via l’appariement de bases avec des ARNm [33]. La « séquence de graines » de miARN avec deux à huit nucléotides à l’extrémité 5' se lie au site de correspondance complémentaire dans le 3'UTR des ARNm, entraînant l’inhibition de la traduction et de l’expression du gène cible ou la dégradation de l’ARNm [34]. Une augmentation du nombre de sites de liaison putatifs aux miARN (6) a été prédite dans le 3'UTR du transcrit BLDef1 par rapport au transcrit HLDef1 (3). De même, un nombre accru de sites de liaison putatifs aux miARN (5) a été prédit dans le 3'UTR de BLDef2 par rapport au transcrit HLDef2 (4). Ces résultats suggèrent que l’expression de BLDef1 et de BLDef2 est plus susceptible d’être régulée à la baisse que celle de HLDef1 et HLDef2 dans le pou de tête. Par conséquent, l’expression relativement réduite de BLDef1 et BLDef2 dans les poux de corps semble contribuer à améliorer la compétence vectorielle [5].

Comprendre le système immunitaire d’un vecteur de transmission de maladie humain est d’une grande importance car c’est le système immunitaire qui détermine en grande partie la compétence du vecteur. Cependant, la cascade de défense immunitaire contre les agents pathogènes bactériens, tels que B. quintana, R. prowazekii et B. recurrentis, chez les poux de corps reste encore largement inconnue. Néanmoins, nous avons élucidé (i) que les poux de corps ont une défensine 2 fonctionnellement modifiée, qui est significativement moins efficace contre B. quintana, un agent pathogène modèle utilisé dans cette étude, et (ii) que l’expression de la défensine 1 et de la défensine 2 est probablement régulée à la baisse en raison de la différence dans les séquences régulatrices pour la liaison au facteur de transcription et la liaison au miARN. Par conséquent, la compétence vectorielle relativement plus élevée des poux de corps semble être principalement due à l’activité antibactérienne réduite de la défensine 2 contre les bactéries pathogènes et aux quantités plus faibles de BLDef1 et de BLDef2.

La défensine 1 et la défensine 2, les seuls peptides antimicrobiens présents dans le corps humain et les poux de tête, présentent des différences de structure et d’activité antimicrobienne. Les activités antibactériennes significativement plus faibles de la défensine 2 ainsi que la probabilité réduite d’expression de la défensine et d’activités de transcription chez les poux de corps contribuent probablement à la relaxation de la réponse immunitaire à la prolifération et à la viabilité de B. quintana, ce qui entraîne une compétence vectorielle plus élevée des poux de corps par rapport aux poux de tête. Ces données faciliteront une compréhension approfondie de la compétence vectorielle différentielle médiée par les défensines 1 et 2 entre les poux du corps et de la tête.

Sans objet.

Peptide antimicrobien

Défensine de pou de corps

Unité formant colonie

Difforme

Facteur E2

Même sauté

Bossu

Pou de tête défensif

Concentration inhibitrice demi-maximale

Les mères contre le dpp

MicroARN

Solution saline tamponnée au phosphate

Jumelé

Globules rouges

Anoure

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Nous tenons à remercier le professeur Jane Koehler (Université de Californie, San Francisco) pour la souche B. quintana JK31 et le professeur Jinki Yeom (Collège de médecine de l’Université nationale de Séoul) pour ses discussions perspicaces.

Ce travail a été soutenu en partie par l’hôpital universitaire national de Séoul. DEL a été soutenu par le programme Brain Korea 21 Four.

Research Institute of Agriculture and Life Sciences, Seoul National University, Séoul, 08826, République de Corée

Kyungjae Andrew Yoon & Si Hyeock Lee

Département de biotechnologie agricole, Université nationale de Séoul, Séoul, 08826, République de Corée

Do Eun Lee & Si Hyeock Lee

Département de médecine tropicale et de parasitologie, Collège de médecine de l’Université nationale de Séoul, Séoul, 03080, République de Corée

Ju Hyeon Kim

Institut des maladies endémiques, Collège de médecine de l’Université nationale de Séoul, Séoul, 03080, République de Corée

Ju Hyeon Kim

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KAY a mené des expériences et a écrit le manuscrit. DEL a mené des expériences. SHL et JHK ont conçu l’étude. JHK a supervisé le travail de recherche et a écrit le manuscrit. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.

Correspondance avec Ju Hyeon Kim.

Le système d’élevage in vitro des poux du corps et de la tête utilisant du sang humain et le dosage hémolytique des défensines des poux du corps et de la tête ont été examinés et approuvés par le Conseil d’examen institutionnel de l’Université nationale de Séoul, IRB No. E2211/001-003.

Sans objet.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

Amorces utilisées pour l’expression in vitro de la défensine 1 et 2 des louses du corps et de la tête.

Activités hémolytiques des défensines recombinantes des poux du corps et de la tête et des antibiotiques.

Alignements de séquences d’acides aminés de la défensine 1 et 2 du pou du corps et de la tête et d’autres espèces d’insectes. Six résidus de cystéine conservés sont marqués par des cases rouges.

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Réimpressions et autorisations

Yoon, K.A., Lee, D., Lee, S. et coll. Explorer le rôle potentiel des défensines dans la compétence vectorielle différentielle des poux du corps et de la tête pour Bartonella quintana. Parasites Vecteurs 16, 183 (2023). https://doi.org/10.1186/s13071-023-05802-4

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Reçu: 21 février 2023

Acceptée: 08 mai 2023

Publication : 6 juin 2023

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Exploration du rôle potentiel des défensines dans la compétence vectorielle différentielle des poux de corps et de tête pour Bartonella quintana